Die grundlegende Aufgabe der Kreuzherren zur Zeit ihrer Gründung war der Spitaldienst: Sie dienten Gott durch ihre Nächsten. Damals wurde das Spitalwesen anders verstanden als heute, wo wir unter einem Spital ein Krankenhaus verstehen. Für die Zeitgenossen der hl. Agnes ging es nicht nur um die Pflege der Kranken. Die Ordensleute kümmerten sich auch um Waisen, alte Menschen und Menschen mit verschiedenen Beeinträchtigungen und boten Pilgern und Studenten Unterkunft.
Nach den Hussitenkriegen, in einer Zeit großen Priestermangels, übernahmen die Kreuzherren verlassene Pfarreien in den böhmischen Ländern und widmeten sich intensiv der Seelsorge. Beide Aufgaben, die geistliche wie die hospitalische, sucht der Orden bis heute zu erfüllen. In ganz Tschechien und auch in Wien wirken die Ordenspriester in der Pfarrseelsorge. Der Orden besitzt zwar kein eigenes Krankenhaus mehr, ist jedoch Patron einer Abteilung des Krankenhauses der Barmherzigen Schwestern vom hl. Karl Borromäus in Prag unterhalb des Petřín und stellt ihr Mittel für neue Geräte zur Verfügung.
Im Ordensareal an der Karlsbrücke befindet sich die Katholische Mädchenschule, die Mädchen mit verschiedenen gesundheitlichen und sozialen Benachteiligungen ausbildet. Am selben Ort wirken der Pflegedienst der Kreuzherren und das ambulante Hospiz St. Agnes von Böhmen. Die neueste Aktivität ist die Gründung des Juvenats, eines Ordenswohnheims für Studierende der Prager Hochschulen. Im Kloster in Český Krumlov (Krumau) ist die Restaurierungsfachschule St. Agnes von Böhmen untergebracht. Die Pflege des kulturellen und historischen Erbes ist ein fester, wenn auch anspruchsvoller Teil der Arbeit des Ordens.
